本文转载自安捷伦细胞分析微信公众号。
细胞分析可以提供直观而丰富的试验结果，但是其过程也面临着诸多的挑战，回忆一下，当你小心翼翼地对你精心呵护的细胞完成一系列操作之后，满怀期待的打开显微成像系统，对即将呈现在你眼前的美丽又可爱的细胞倩影满怀期待的时候，你是否
因为总是找不到细胞或者焦平面而急躁？
因为刚刚找到的视野又不见了而悔恨？
因为前几个小时还神采奕奕的细胞突然就垮了而懊恼？
十个提升细胞成像分析成功率的小技巧送给你！
1.样品制备
高品质的细胞样品是确保获得高质量图像的关键一步。
细胞收集
首先，收集细胞前应确认培养瓶或者培养皿中的细胞已达到足够的密度，注意使用合适的消化液消化细胞，避免影响细胞基本功能。在实验过程中执行严格的无菌操作以防止污染，避免外来颗粒或细胞碎片对影响图像质量。
条件优化
活细胞成像分析使用的荧光探针需要具有细胞膜透过性，以评估胞内的结构和功能。因此在进行正式实验之前，需要对荧光探针的浓度和孵育时间进行优化，确保孵育后细胞活力不受影响的同时，实验中仍然能够检测到合适的荧光信号强度。此外，还需要注意潜在的背景荧光，针对这一点，可以考虑在成像前加入洗涤步骤。以上这些方法有助于获得具有良好信噪比的活细胞图像。
而对于如免疫荧光等固定的细胞分析来讲，建议使用经过验证的固定、透化以及染色方案，包括添加封闭液防止非特异性结合，在必要时优化抗体浓度。
2． 耗材使用注意事项
器皿底部厚度
用于显微镜观察的器皿底部厚度很重要，因为倒置显微镜是需要透过这个厚度来观察样品的。不同耗材有不同的底部厚度，一些常见的耗材底部厚度包括：
Ø玻璃盖玻片：0.17 mm
Ø常规塑料微孔板：0.5 mm
Ø低密度微孔板：1.0 mm
专为成像而开发的新型微孔板，其底部厚度更接近于盖玻片。当使用较低数值孔径（NA<0.7）物镜进行成像时，耗材底部厚度不会产生很大影响。然而，当使用高数值孔径（NA≥0.8）的空气镜时，即便厚度仅有几微米的变化也会导致图像降质。且图像质量会随耗材厚度的增加而变差。
根据耗材底部厚度调整校正环
长工作距离物镜可以兼容不同底部厚度的器皿，来进行活细胞成像观察。而这类物镜上会有一个校正环，通过调节校正环的位置就可以调节物镜内透镜组之间的距离，确保了无论使用哪种类型的器皿都能够精确对焦。所以成像前可以先检查物镜校正环位置是否正确，避免事倍功半。
物镜校正环
3． 细胞数量优化
对于常规实验而言，可分析的细胞数量越多，其结果就越可靠。然而对于细胞成像来说并非如此。细胞接种数量过多，会导致细胞叠加生长，使细胞难以区分，不利于细胞计数以及进行其他评估。细胞接种数量过少，则会失去统计学意义，还会造成细胞亚群分析的偏离。
实验的后续处理和培养过程中细胞的数量的变化也应纳入考虑范围，因为细胞增殖在实验的准备和进行过程中始终持续发生。
4． 细胞类型
应用于成像实验的细胞类型是多种多样的，包括永生化细胞系、原代细胞和干细胞等。需要根据细胞类型选择合适的对焦方式和成像方式。
二维细胞层
在显微镜实验中使用的多数细胞是贴壁细胞或者半贴壁细胞；经过正确的处理，这些细胞会附着在孔板底部并形成二维（2D）细胞层，因为细胞在一个平面上，可利用成像仪的自动聚焦功能实现对焦
悬浮细胞
悬浮细胞，例如红细胞和白细胞，也可以成像，但此类细胞缺乏附着于表面的能力，需要额外操作将细胞限制在器皿表面，实现单一焦平面聚焦。悬浮细胞成像可以使用带有盖玻片的显微镜载玻片，或者带盖玻片的血细胞计数器上，通过盖玻片限制细胞在轴向上移动，从而提供更好的图像清晰度。当使用微孔板时，也可以通过离心将细胞固定至板底。
组织和三维细胞结构
更复杂的生物学研究，需要对组织和三维（3D）细胞结构进行成像分析。和 2D 单层细胞实验相比，大小和形状的差异使得组织和 3D 细胞成像需要更先进的成像技术。组织样品通常会比显微镜物镜提供的视野大得多，尤其是在使用高倍物镜要求高分辨率的情况下，因此，组织成像可以使用有蒙太奇自动拼接功能，将多视野图像准确拼接成一张高分辨率大图用于分析。
3D 细胞结构由成百上千个细胞构成，这些细胞不仅在 X 轴和 Y 轴上延伸，也在 Z 轴上延伸。使用 Z 轴层切成像和叠加可以为具有挑战性的研究如 3D 细胞、类器官或者有一定厚度的样本分析提供完全聚焦视图，同时也增加了后续分析的准确度。
5． 荧光基团和荧光通道的选择
激发和发射光谱
选择合适的荧光基团对于成像是至关重要的。荧光探针或蛋白的激发和发射光谱应与 LED 光源、激发和发射滤光片以及二向色镜相匹配，以确保获得满意的荧光信号。
斯托克斯位移（Stokes shift）
荧光基团的斯托克斯位移是一个需要考虑的重要变量，狭窄的斯托克斯位移会导致背景荧光过度，信噪比降低。所以如果需要多个荧光基团一起使用，则应该进行额外的优化。分子光谱往往很宽，激发和发射光谱都可能会发生重叠，导致一个荧光基团渗透到另一个的荧光通道。因此，当两种荧光基团在细胞内同一区域做共定位时，这一点要尤为注意。
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